? ? ? ?柱色譜法是一種常用于分離復(fù)雜混合物中分子的方法。與平面色譜不同，在柱色譜中固定相或樹(shù)脂被填充到色譜柱中。然后流動(dòng)相通過(guò)填充的固定相以實(shí)現(xiàn)分離。這種分離的目的可以是分析性的或制備性的。柱層析在玻璃、塑料或金屬柱內(nèi)的填充三維固定相上進(jìn)行，可用于制備和分析目的。柱層析技術(shù)包含基于不同固相和液相化學(xué)和柱配置的廣泛應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)精確分析以及分離難以或不可能通過(guò)其他方法分離的復(fù)雜混合物。

? ? ? ?有許多系統(tǒng)可用于液相色譜，系統(tǒng)的選擇取決于所需分離的復(fù)雜性。流動(dòng)相可以通過(guò)重力流、使用離心力或使用基于泵的自動(dòng)系統(tǒng)通過(guò)固定相。基于泵的系統(tǒng)范圍從由蠕動(dòng)泵和餾分收集器組成的更簡(jiǎn)單的低壓色譜系統(tǒng)到復(fù)雜的中壓色譜系統(tǒng)和包括多波長(zhǎng)檢測(cè)器和緩沖液混合功能的高壓液相色譜系統(tǒng)。因此，柱色譜根據(jù)所用流體流動(dòng)系統(tǒng)的類型進(jìn)行分類：重力色譜、低壓層析、中壓色譜（包括快速蛋白液相色譜）、高壓/高效液相色譜(HPLC)。其中，重力色譜通常用于小規(guī)模的制備色譜。低壓和中壓色譜系統(tǒng)通常用于中等規(guī)模的制備應(yīng)用。中壓系統(tǒng)用途更廣可用于分析和制備目的。高壓系統(tǒng)允許對(duì)蛋白質(zhì)或小分子進(jìn)行高分辨率分離，最常用于分析目的。

一、重力色譜：

? ? ? ?重力色譜利用重力使樣品和緩沖液通過(guò)分析柱的樹(shù)脂。盡管預(yù)裝重力柱在市場(chǎng)上有售，但實(shí)驗(yàn)室自己裝柱填充的情況并不少見(jiàn)。重力色譜法是一種低成本、簡(jiǎn)單的制備色譜法，但它不能提供高分辨率。重力色譜可應(yīng)用于核酸、肽和蛋白質(zhì)的小規(guī)模、快速制備層析等方面。

二、低壓層析：

? ? ? ?低壓層析系統(tǒng)在低于 50 psi (0.35 MPa) 的壓力下運(yùn)行。這些系統(tǒng)需要一個(gè)樣品泵并且通常配備餾分收集器、梯度能力和檢測(cè)器來(lái)監(jiān)測(cè)柱洗脫。低壓系統(tǒng)與預(yù)裝柱兼容，并提供比重力色譜更大的靈活性和更高的分辨率。盡管如此，低壓層析并不是一種適用于復(fù)雜蛋白質(zhì)純化的高分辨率層析方法。低壓層析應(yīng)用于天然或重組蛋白質(zhì)的中等規(guī)模制備層析。

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三、中壓色譜：

? ? ? 中壓色譜，也稱為快速蛋白液相色譜，更適用于復(fù)雜的純化，也可用于分析目的。中壓色譜法是在實(shí)際上相當(dāng)高的操作壓力下進(jìn)行的，最高可達(dá) 3500 psi (24 MPa)。中壓色譜系統(tǒng)通常包括附加功能，例如柱切換閥、高級(jí)梯度功能和多波長(zhǎng)檢測(cè)器。這些系統(tǒng)與各種預(yù)裝柱和樹(shù)脂兼容，中壓色譜可應(yīng)用于簡(jiǎn)單的重組蛋白純化以及從非揮發(fā)性有機(jī)物到核酸、肽和蛋白質(zhì)的分析目的。

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四、高壓液相色譜：

? ? ? ?高壓液相色譜法 (HPLC)也稱為高效液相色譜法，是在高達(dá) 5,000 psi (34 MPa)的壓力下進(jìn)行的。HPLC 是一種強(qiáng)大的分析工具，具有高分辨率和靈敏度，能夠檢測(cè)低至萬(wàn)億分之一的濃度，同時(shí)具有非常小的樣品需求。由于 HPLC 系統(tǒng)可以在更高的壓力下運(yùn)行，因此可以減小樹(shù)脂的粒徑，從而提高樹(shù)脂的分辨率。

? ? ?使用 HPLC 分析的化合物種類很多，所以HPLC 系統(tǒng)通常具有多種類型的檢測(cè)器。一種常見(jiàn)的組合是紫外吸光度檢測(cè)器與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (ELSD) 和/或質(zhì)譜儀 (MS) 的組合。HPLC 和質(zhì)譜法的結(jié)合產(chǎn)生 HPLC-MS，通常縮寫(xiě)為 LC- MS，一種非常強(qiáng)大的分析工具，用于環(huán)境采樣、藥物發(fā)現(xiàn)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究等應(yīng)用。

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